致肾盂肾炎大肠杆菌粘附基因群DNA多态性的研究

　　中国人兽共患病杂志2000年第16卷第3期

陈锦英　李宝艳　李方涛　陈贻锴

　　摘　要：目的　研究临床分离的致肾盂肾炎大肠杆菌粘附基因群DNA的多态性。方法　以血凝试验（MRHA）为基础，分别用编码P菌毛主体结构和尖端粘附素的基因探针，采用DNA杂交方法对临床分离的95株尿源性大肠杆菌的粘附基因群进行分析。结果 mRHA+++～++++占37.9%（36株），++占32.6%(31株)，MRHA阴性占29.5%(28株)。菌落原位杂交和DNA斑点杂交试验在MRHA+++～++++，++和阴性菌株中两个探针均为阳性的分别为91.7%、9.7%和21.4%；在MRHA++和阴性菌株中单一探针阳性的分别为64.5%和35.7%。同时，选10株MRHA++++大肠杆菌提取染色体DNA，经EcoRⅠ酶切后Southern杂交进行限制性片段长度多态性分析，同源性DNA片段大小不一，杂交信号的强弱程度也不同。结论　提示致肾盂肾炎大肠杆菌pap粘附基因群的多样性。

　　关键词：致肾盂肾炎大肠杆菌　粘附基因群　血凝　DNA杂交　限制性片段长度多态性

　　大肠杆菌是肾盂肾炎的主要致病菌，80%～100%的菌株具有P菌毛。带有P菌毛的大肠杆菌可引起人的P血型红细胞凝集，且不被甘露糖所抑制，称为致肾盂肾炎大肠杆菌（Uropathogenic e.coli， UPEC）编码P菌毛的粘附基因群位于UPEC的染色体上，国外的研究表明不同菌株中该基因群存在结构和拷贝数的变异^［1，2］，国内这方面研究尚处于空白。本研究以血凝试验为基础，分别用编码P菌毛主体结构和P菌毛尖端粘附素的基因探针经原位杂交和Southern杂交的方法对临床分离的95株尿源性大肠杆菌的粘附基因群进行分析，探明国内菌株的特点，为进一步防治研究奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　菌株、质粒和培养基　95株大肠杆菌自天津医科大学总医院和第二医院1992～1997年尿路感染病人的尿标本中分离所得，均经常规方法鉴定证实。所使用的质粒有pPIL110-70、pPIL110-37、pANN921、pPIL288-10、pPIL291-15、pCT-10、pDC1，分别带有血清型为F71、F72、F8、F9、F11、F13和Clegg的P菌毛的大肠杆菌染色体粘附基因群。E.coli k-12 p678-54为无菌毛代表株。实验用的培养基为LB固体和液体培养基，对不同抗性的质粒菌株所用培养基中含抗生素的浓度为氨苄青霉素50mg/L、四环素20mg/L、氯霉素20mg/L。

　　1.2　内切酶和试剂　限制性内切酶EcoRⅠ、SmalⅠ、HindⅢ由GIBCO公司提供，鲑精DNA、RNase、蛋白酶K、硝基纤维素膜购自天象人公司，随机引物标记盒由Promaga公司提供，［α-³²P］dNTP由北京亚辉生物医学工程公司提供。

　　1.3　血凝试验　按参考文献^［3］方法进行，结果判断以出现≥++凝集为MRHA阳性。

　　1.4　探针的制备和标记

　　1.4.1　制备模板^［4］　用碱裂解法提取pCT-10质粒DNA，分别经SmalⅠ和HindⅢ内切酶消化后经琼脂糖凝胶电泳，透析袋法回收目的DNA片段，-20℃保存。

　　1.4.2　用随机引物法合成放射性标记探针和掺入率的测定　按试剂盒说明书操作。

　　1.4.3　原位杂交和染色体DNA斑点杂交　按文献^［2，3］进行。Southern杂交首先提取待检菌染色体DNA，取适量染色体DNA经EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳，用毛细管转移法将DNA转移到硝基纤维素膜上。Southern杂交按文献^［4］进行，同时用68℃水溶液杂交与甲酰胺存在条件下42℃杂交进行比较。-70℃放射自显影48小时。

　　1.5 统计学方法　采用四格表法的χ²检验和确切概率法。

　　2　结果

　　2.1　血凝试验结果　95株尿源性大肠杆菌中36株（37.9%）+++～++++，31株（32.6%）++，28株（29.5%）MRHA阴性（包括-～+）。

　　2.2　探针制备和标记结果　在UPEC中以F13型粘附基因群研究得比较详细，pap基因群约9.8kb。用4.0kb hindⅢ片段（包括papA、C、D、H）及2.5kb SmalⅠ片段(包括papE、F、G)作为探针，检测临床菌株pap基因群。用同位素标记后测得papACDH探针比活为1.0×10⁹cpm/μg，papEFG比活为21.6×10⁹cpm/μg。

　　2.3　菌落原位杂交和DNA斑点杂交结果　7个不同血清型的P菌毛代表株探针杂交均为阳性。将95株尿源性大肠杆菌用papACDH和 papEFG的放射性探针进行菌落原位杂交和DNA斑点杂交，二者结果基本一致，后者图象更为清晰。同时用68℃水溶液和甲酰胺存在下42℃杂交相比较，前者效果更好。

表1　尿源性大肠杆菌pap粘附基因群原位杂交的结果

　　table 1　Results of pap adherence gene cluster hybridization in situ of E.coli strains isolated from urine

　　*各组两个探针均阳性和阴性的结果经χ²检验(χ²test of two probe positive or negative results)：A/B组(A/B group)：χ²=19.22，P＜0.01 a/C组(A/C group)：χ²=20.35，P＜0.01 B/C组(B/C group)：χ²=0.952，P＞0.05　　从表1可以看出papACDH 和papEFG两个探针均阳性的结果在MRHA+++～++++(A组)，MRHA++(B组)和阴性(C组)菌株中分别为91.7%(33/36株)，9.7%(3/31株)和21.4%(6/28株)。值得注意的是在MRHA++和阴性菌株中单一探针杂交阳性者分别为64.5%（20/31株）和35.7（10/28株），而在MRHA+++～++++组中无此现象。将各组两个探针均为阳性和阴性的结果经统计学处理发现A/B组和A/C组之间均非常显著性差异（P＜0.01），而B/C组相比较则无显著性差异（P＞0.05）。

　　2.4　Southern杂交结果　已知编码P菌毛的粘附基因群没有EcoRⅠ识别位点，选取10株MRHA+++～++++UPEC菌株提取其染色体DNA，经EcoRⅠ酶切后分别用上述两个探针做Southern杂交，对同源性片段进行限制性片段长度多态性分析（RFLP），结果见表2。从中可见，两个探针的杂交结果并不完全一致，受检菌株中1206菌株papACDH探针杂交阴性，而papEFG探针杂交阳性。受试菌与探针同源的DNA片段大小并不一致，其分子量在14.45～28.84kb之间，1211菌株papEFG探针杂交结果出现了24.66kb和14.45kb两条带。此外，各菌株杂交信号强弱程度相差也较大。

表2　致肾盂肾炎大肠杆菌Southern杂交分析

　　table 2　Southern hyberidization of uropathogenic E.coli

　　3　讨论　　引起尿路感染的大肠杆菌具有特殊的菌毛，是该菌不同于肠道大肠杆菌的重要特征。其中Ⅰ型菌毛和F型菌毛与下尿路感染有关，不引起P血型红细胞的MRHA。M菌毛和X菌毛的受体成分与P血型抗原物质α-D-半乳糖-（1-4）-β-D-半乳糖不同，在引起肾盂肾炎的大肠杆菌中多数表达P菌毛，其粘附作用是发病的关键，也是UPEC的重要特征^［1］。

　　编码P菌毛的粘附基因群也称为pap粘附基因群，位于UPEC的染色体上，由11个功能各异的基因组成，其中papA、H、C、D、J参与菌毛主体结构的形成；papK、E、G、F参与菌毛尖端粘附素的形成，负责菌毛特异性的粘附；papI、B在菌毛合成中起调节作用^［6］。为此，我们分别选用粘附基因群中编码P菌毛主体结构的HindⅢ片段和编码P菌毛尖端粘附素的SmalⅠ片段作为探针研究粘附基因群DNA多态性。菌落原位杂交的结果显示MRHA+++～++++菌株中两个探针均阳性者占91.7%，选择其中10株菌进行pap相关序列的RFLP分析，结果与探针同源的DNA片段分子量不同，且杂交信号强弱程度也有差别。同时，在MRHA++和阴性菌株中菌落原位杂交是单一探针杂交阳性者居多，表明受检菌株pap粘附基因群的多样性，与国外报道相一致^［1，2］。Swenson等的研究表明编码UPEC毒力因子的基因由染色体上特定的大片段DNA所携带，称其为致病岛（pathogenicity island），可移动成分促进了致病岛毒力基因在细菌之间的播散^［7］。本文结果也提示了这种播散和演变的过程可能极为复杂。此外，还应注意到在MRHA阴性菌株中尚有21.4%为探针杂交阳性，而粘附基因群并未表达，这种情况是否与致病菌和宿主细胞接触后产生某种信号，然后激发毒力基因转录的报道有关，尚待证实^［8］。

　　本文菌落原位杂交中两个探针均为阳性的结果在MRHA+++～++++、++和阴性菌株中分别为91.7%（A组）、9.7%（B组）、和21.4%（C组），A/B组和A/C组相比较有非常显著性差异（P＜0.01），而B/C组相比较则无显著性差异（P＞0.05），表明以MRHA+++～++++确定为UPEC菌株可能更为妥当。因为尿道致病大肠杆菌中还有M菌毛和X菌毛，分别引起M血型和Dr血型的MRHA，红细胞表面会有M、P和Dr血型遗传标志的交叉，这种现象可能在MRHA++菌株中更为多见，MRHA+++～++++菌株中也有3株探针杂交阴性者或许与此有关。血凝试验一般以出现≥++凝集为阳性，为此在单独用血凝试验进行UPEC鉴定时应引起注意。

　　(de Ree JM和Hull RA赠送标准菌株，天津医科大学总医院和第二医院细菌室提供临床菌株，特致谢)

　　本研究系国家自然科学基金资助陈锦英（天津医科大学　天津，300070)

　　李宝艳（天津医科大学　天津，300070)

　　李方涛（天津医科大学　天津，300070)

　　陈贻锴（福建医科大学）

　　参考文献

　　1，Arthur M， Arbeit RD， kim C， et al. Restriction fragment length polymorphisms among uropathogenic e.coli isolates： pap-related sequences compared with rrn operons［J］. infect Immun， 1990，58(2)∶471.

　　2，Hull SI，Bieler S， Hull RA. Restriction fragment length polymorphism and multiple copies of DNA sequences homologous with probes for P-fimbriae and hemolysin genes among uropathogenic Escherichia coli［J］. Can J Microbiol，1988，34∶307.

　　3，苏琦华，陈锦英，何健民，等.尿源性大肠杆菌耐药性及其与粘附性关系的研究.天津医药，1993，2（2）∶67.

　　4，金冬雁，黎孟枫，等译.分子克隆实验指南［M］第2版，北京：科技出版社，1993，19～22，61～68，474～479.

　　5，林万明主编.核酸探针杂交技术.北京，中国科技出版社，1991，175～178.

　　6，Hultgren SJ，Normark S. Chaperone-assisted assembly and molecular architecture of adhesive pili［J］. Annu Rev Microbiol，1991，45∶383.

　　7，Swenson DL，Bukanov NO，Berg DE，et al. Two pathogenicity islands in uropathogenic E.coli J96：cosmid cloning and sample sequencing［J］.Infect immun， 1996，64(9)∶3736.

　　8，Groisman EA， Ochmant H. Pathogenicity islands：bacterial evolution in quantum leaps［J］.Cell，1996，87∶791.