人重组粒细胞集落刺激因子突变体的构建、表达和其体内外生物学活性研究
中华微生物学和免疫学杂志 1999年第4期第19卷 细胞因子
作者：李芳 莫晓宁 张颖妹 袁岚 饶严 范中玉 袁勇 曹志敏 马大龙
单位：100083北京医科大学卫生部医学免疫学重点实验室
关键词：定点突变；人重组粒细胞集落刺激因子
【 摘要 】 目的 为提高人重组粒细胞集落刺激因子(human recombinant granulocyte colony-stimulating factor, rhG-CSF)的稳定性和活性，对rhG-CSF进行改造和体内、外活性研究。方法 利用定向点突变技术，将人重组粒细胞集落刺激因子第17位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列，DNA序列分析证明后，在大肠杆菌中表达突变蛋白。利用G-CSF依赖细胞株NFS-60，对在不同温度及在人血浆中保存的G-CSF蛋白(G-CSF-Ala17)和野生型的G-CSF进行活性测定。腹腔注射后小鼠外周血白细胞计数检测其体内生物学活性。结果 DNA序列分析表明17位半胱氨酸突变为丙氨酸，并在大肠杆菌中表达成功G-CSF-Ala17。纯化的突变蛋白对NFS-60细胞具有刺激活性；与野生型G-CSF相比，在各种温度储存的突变蛋白保留更高的活性，与人血浆孵育50小时后突变蛋白仍保持活性；小鼠一次性体内注射突变蛋白后外周血白细胞数明显高于野生型G-CSF。结论 G-CSF突变体(G-CSF-Ala17)较野生型的G-CSF具有更高的体外稳定性和体内造血刺激活性。
Studies on a mutant human granulocyte colony-stimulating factor and its bioactivity both in vitro and in vivo LI Fang, MO Xiaoning, ZHANG Yingmei, et al. Laboratory of Medical Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083
【 Abstract 】 Objective To reconstruct rhG-CSF for improvement of its stability and bioactivity.Methods By using the technique of site-specific mutagenesis with a synthetic oligonucleotide primer, we replaced the codon for cysteine-17 of human G-CSF with alanine, confirmed by DNA sequencing and expressed the mutant protein (G-CSF-Ala-17) in Escherichia coli. The biological activity of the furified protein was determined with colorimetric microassay using G-CSF-dependent NFS-60 cells under different temperatures and in human plasma at 37℃. After intraperitoneal administration of the G-CSF-Ala-17 or wild G-CSF, the peripheral leukocytes in normal mice were determined.Results The mutant G-CSF was successfully constructed and expressed in E. coli. Purified G-CSF-Ala-17 protein had stimulating activity similar to the wild type of G-CSF as assayed by G-CSF-dependent NSF-60 cells. However, the stability of the G-CSF-Ala-17 was superior than that of G-CSF at different temperatures, and retained full biological activity after 50 hours culture in human plasma, as control. The G-CSF-Ala-17 has a higher stimulatory activity to the granulocytes than that G-CSF after intraperitoneal administration into normal mice.Conclusions G-CSF-Ala-17 has an advantage over wild type of rhG-CSF in storage stability and hemotopoietic activity in vivo.
【 Subject words 】 Site-directed Mutagenesis Mutant G-CSF Stability
人G-CSF是调节中性粒细胞增殖和分化的重要细胞因子〔1〕，其 cDNA已成功克隆，并在大肠杆菌等工程细胞中获得表达〔2，3〕。人重组G-CSF的临床研究证明，它能显著提高人粒细胞的数量，尤其是在各种原因引起白细胞下降的病人〔4〕，并且作用迅速，副作用小。但G-CSF也存在体内半衰期短和体外贮藏稳定性较差的缺点，影响了它的广泛应用。许多研究表明，细胞因子不稳定因素可能与其结构相关。人G-CSF 在17位有一个游离的半胱氨酸和两个二硫键(Cys36-Cys42和Cys64-Cys74)〔5〕。已知白细胞介素-2〔6〕，T4溶菌酶〔7〕和干扰素β〔8〕都有一个游离的半胱氨酸，易形成分子间的二硫键，产生无活性的寡聚体。用苏氨酸或丙氨酸取代T4溶菌酶上游离的Cys54，新产生的突变蛋白对不可逆的热灭活具有明显增加的稳定性，而用丝氨酸或丙氨酸取代IL-2 Cys125产生的突变克隆具有较高的稳定性。我们利用新的技术路线进行了人重组G-CSF-Ala17的构建和表达，以对G-CSF-Ala17进行更深入的研究。首先发现，G-CSF-Ala17较野生型G-CSF除具有更高的稳定性外，还具有更高的体内生物学活性。
材料与方法
1.质粒、菌株、细胞及实验动物：表达载体质粒pKpL-3a为本室构建〔10〕 ，含有启动子和SD序列；pALTER-1 突变载体和pEGM-3 测序载体购于Promega 公司。大肠杆菌pop2136由Raiband博士惠赠，含有编码温度敏感的λ阻遏蛋白的CI857基因，30℃抑制pL启动子表达外源基因，42℃诱导λ阻遏蛋白失活，启动pL下游的外源基因表达。NFS-60 白血病细胞株，为G-CSF依赖株，由中国药品生物制品检定所丁锡申教授惠赠。 BALB/c小鼠，由北京医科大学实验动物部提供。
2.DNA重组技术:质粒提取、酶切、回收、连接、转化、鉴定、PCR扩增等参考文献〔10〕操作。
3.合成寡核苷酸:设计合成26个核苷酸的突变引物：5＇-TTC CTG CTG AAG GCC TTA GAG CAA GT-3＇，上述引物与人G-CSF cDNA负链的第37～62个核苷酸互补，将其中第13，14个碱基由TG变为GC，相应的三连码所编码的氨基酸由半胱氨酸变为丙氨酸，同时产生一个StuⅠ位点AGGCCT，这一新的酶切位点可用于筛选突变克隆。
4.DNA序列分析:利用Pharmacia公司的ALF自动测序仪，按照说明书测序。
5.G-CSF基因的定点突变: rhG-CSF表达载体pKpL-G-CSF含有完整的G-CSF cDNA，用SalⅠ、HindⅢ消化，产生的SalⅠ-HindⅢ小片段连接到用相同酶消化的突变载体 pALTER-1,构建成pALTER-G-CSF质粒，按Promega公司说明书用合成的突变寡核苷酸进行定点突变，经DNA测序确认后将突变的G-CSF基因片段插入pKpL-3a表达载体，命名为pKpL-G-CSF-Ala-17。
6.突变G-CSF基因表达及蛋白的纯化:按照本室方法进行G-CSF-Ala-17在大肠杆菌pop2136中的热诱导表达，经变性复性，离子交换柱层析纯化后，利用SDS -PAGE和FPLC分析纯度。
7.生物学活性测定: 选用G-CSF依赖细胞株NFS-60，以MTT染料掺入法测定G-CSF-Ala-17的生物学活性〔9〕。
8.G-CSF-Ala-17在正常人血浆中的稳定性测定: pH7.4的PBS稀释为20μg/ml的G-CSF-Ala-17，再用新鲜健康人血浆稀释为1μg/ml，置37℃水浴孵育48小时，在0，12，24，36，48小时取样，分别测定其活性，同时用G-CSF对照。
9.G-CSF-Ala-17在不同温度下的储藏稳定性检测: 将G-CSF-Ala-17或G-CSF蛋白分装后分别置-20℃、4℃、37℃放置，经一定时间取样，测定其活性。
10.G-CSF-Ala-17的小鼠体内实验:取每组10只小鼠，一次腹腔注射2μg G-CSF-Ala-17蛋白或G-CSF，分别在0，2，4，8，12，16，24，30小时采血检测外周血中白细胞数量。
结 果
1.G-CSF-Ala-17表达质粒的构建和鉴定：G-CSF-Ala-17表达载体pKpL-G-CSF-Ala-17经限制性内切酶HindⅢ、StuⅠ、BglⅠ、StyⅠ、SalⅠ消化，琼脂糖电泳显示出与理论计算大小相符的酶切片段（图略）。
2.G-CSF-Ala-17表达质粒的DNA序列分析:DNA测序结果显示第49，50个核苷酸处出现突变序列，与原设计的结果一致，除此之外，全序列与公布的G-CSF序列相一致（图略）。
3.G-CSF-Ala-17蛋白的表达与纯化:SDS-PAGE结果表明，pKpL-G-CSF-Ala-17质粒在工程菌pop2136中可表达相对分子质量约18×103的蛋白，此蛋白以包涵体的形式存在，经变性、复性、离子交换柱层析后，可得到纯化的G-CSF-Ala-17蛋白（图1），纯度经FPLC分析，可达98.2%, SDS-PAGE Imager Marster 薄层扫描纯度为98.9%。
图1 G-CSF-Ala-17的SDS-PAGE结果
Fig 1. G-CSF-Ala-17 SDS-PAGE
1.Purified G-CSF-Ala-17; 2.G-CSF-Ala-17 inclusive body;3.Lysate supernatant; 4.Pre-induced expression strain
4.G-CSF-Ala-17对NFS-60细胞的体外刺激作用：纯化的G-CSF-Ala-17蛋白对NFS-60细胞体外活性测定表明，其活性为107～108U/mg，与野生型G-CSF(107～108U/mg)活性相比，活性无差异（图略）。
5.G-CSF-Ala-17在不同温度下储藏稳定性的测定结果:图2显示G-CSF-Ala-17储藏50，70，120，150，210，260天测定结果。
图2 G-CSF-Ala-17体外稳定性测定
Fig 2. The stability of G-CSF-Ala-17 in vitro
6. G-CSF-Ala-17在正常人血浆中稳定性的体外实验: 将G-CSF-Ala-17蛋白或G-CSF蛋白在正常人血浆中37℃ 共同孵育48小时，分别在12，24，36，48小时取样，结果发现G-CSF-Ala-17的活性基本无变化，而G-CSF活性则显著下降（图3）。
图3 突变G-CSF 在正常人血浆中稳定性的体外实验
Fig 3. The stability of G-CSF-Ala-17 in plasma in vitro
7. 对小鼠白细胞增殖的体内实验:小鼠一次性注射G-CSF-Ala-17或G-CSF蛋白2μg后, 不同时间检测外周血白细胞数（图略），发现G-CSF-Ala-17在注射后8小时达最高值，可提高至270%，维持24小时，然后逐渐下降。与G-CSF提高180%相比，G-CSF-Ala-17具有更高的体内刺激活性。
讨 论
人G-CSF含有5个半胱氨酸，其中4个半胱氨酸可形成2个分子间的二硫键，另有第17位半胱氨酸处于游离状态，易于氧化形成无活性的二聚体或寡聚体，影响G-CSF的活性和稳定性。为研究去除G-CSF的游离半胱氨酸后能够在多大程度上改善其生物学活性，我们利用定点突变技术用丙氨酸取代17位半胱氨酸，获得了G-CSF-Ala17突变体蛋白，并对其进行了系统性的活性分析。结果显示，在正常条件下，G-CSF-Ala17的体外比活性与野生型G-CSF相比，虽然活性相同，但前者的体外稳定性明显改善，并且体内生物学活性明显增加。说明G-CSF-Ala17在减少游离半胱氨酸后，不仅提高了结构的稳定性，而且具备了较强的抵抗外界影响的能力，特别是在血浆中的抗降解能力，提示其在体内可能有延长半衰期的作用。虽然结果显示在小鼠体内活性没有明显延长，这可能与人鼠的种属差异和体内外实际条件相差悬殊有关，例如体内对蛋白的清除作用强于体外，但本文结果确实证明G-CSF-Ala17体内活性有明显增高。这可能与其稳定性提高是相关的。上述结果提示，G-CSF-Ala17有可能作为新一代的基因工程药物，更利于生产、贮藏和运输，并且由于其体内半衰期的延长，可减少使用剂量和延长用药间隔，并降低副作用，因而可能具有良好的开发应用前景。
本课题为国家863计划生物技术领域基金资助
参考文献
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(收稿：1998-05-08 修回：1998-08-30)