微量液基稀释法测定化合物特苄康唑的体外抗真菌活性

中国抗生素杂志 2000年第3期第25卷 论　著

作者：曹永兵　姜远英　王宁　殷明　张万年

单位：第二军医大学药学院，上海　200433

关键词：特苄康唑；抗真菌活性；氟康唑；最低抑菌浓度

　　摘　要　参照美国国家临床试验标准化委员会(NCCLS)提出的标准，以氟康唑、酮康唑和布替萘芬为对照，用微量液基稀释药敏试验方法，测定特苄康唑对12种临床常见真菌的最低抑菌浓度(MIC₈₀)。结果除烟曲霉外，特苄康唑对其他11种真菌的MIC₈₀均在4mg/L以下，其体外抗真菌活性明显优于氟康唑，尤其对酵母的抗菌活性是氟康唑的8～256倍，与酮康唑作用相当。结论：特苄康唑在体外具有广谱、高效的抗真菌活性，有进一步研究的价值。

In vitro antifungal activity study of terbiaminazole,a new triazole antifungal agent,by broth microdilution testing

Cao Yongbing，Jiang Yuanying，Wang Ning，Yin Ming，Zhang Wannian

　　(Department of Pharmacology,College of Pharmacy,Second Military Medical University，Shanghai 200433)

　　ABSTRACT　In the broth microdilution testing procedure proposed by the National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS),terbiaminazole,a new triazole antifungal agent,with MICs at which 80% of the strains tested are inhibited (MIC₈₀s) under 4 mg/L,was more active than fluconazole against different fungi.These results demonstrated that ZJ522 has activity against fungi with broad-spectrum and high-potency,superior to that of its analogue fluconazole.

　　KEY WORDS　Terbiaminazole；Antifungal activity；Fluconazole；Minimal inhibitory concentration

　　自1903年Beurmann发现碘化钾能治疗孢子丝菌病以来^［1］，整个20世纪，人们一直在研究对付真菌病的各种方法。20世纪50年代两性霉素B的发现是抗真菌药物研究中的一大突破。60年代开始的对氮唑类化合物的研究，将抗真菌药物研究推向了一个新阶段，尤其是酮康唑、氟康唑和伊曲康唑的相继问世，给真菌病患者带来了福音。但是，在最近的20年中，随着癌症放疗、化疗和器官移植患者人数的增加，免疫抑制剂和广谱抗生素的大量使用，以及爱滋病的广泛流行，深部真菌感染率上升了40倍^［2］，深部真菌感染正日益成为一种常见病、多发病，并已成为引起这类疾病患者死亡的主要原因^［3］。患者由于免疫功能下降或丧失，其真菌病的发生率可高达正常人的1000倍^［4］。另外，真菌的耐药性问题也越来越严重^［5］。目前临床常用的抗真菌药物由于在抗菌效果、不良反应及对付真菌耐药性方面仍存在较多问题，因此，在即将来临的21世纪，抗真菌药物研究必将仍是极具挑战性的课题。

　　羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)是真菌麦角甾醇生物合成通路中的关键酶^［6］，作用于该酶的酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等氮唑类药物在临床抗真菌治疗中具有突出地位，因此，以CYP51为作用靶点的氮唑类化合物一直是抗真菌药物研究的一大热点^［7］。我们在模建白念珠菌CYP51酶三维结构分子模型^［8］和研究氮唑类药物与该酶作用方式^［9］的基础上，通过计算机辅助设计，合成了新的氮唑类化合物特苄康唑(terbiaminazole)(Fig.1)。

　　本文参照1992年美国国家临床试验标准化委员会(NCCLS)提出的标准^［10］，分别建立了酵母和霉的微量液基稀释药敏试验方法，测定了化合物特苄康唑对12种临床常见真菌的体外抗菌活性。

Fig.1　　Chemical structure of terbiaminazole

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　菌株

　　ATCC标准株：白念珠菌(Candida albicans)ATCC76615及其氟康唑耐药株2株、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)ATCC32609分别由长征医院菌种保存中心赠送。

　　临床株：近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、平滑念珠菌(Candida glabrata)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、裴氏着色真菌(Fonsecaea pedrosoi)、紧密着色真菌(Fonsecaea compacta)、申克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、羊毛状小孢子菌(Microsporum canis)、石膏状小孢子菌(Microsporum gypseum)、石膏状毛癣菌(Trichophyto mentagrophytes)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，均由长海医院真菌室提供，并经形态学和生化学鉴定。

　　1.1.2　培养液

　　RPMI 1640培养液：RPMI 1640(Gibco BRL)10g，NaHCO₃ 2.0g，吗啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonic acid，MOPS)(Sigma)34.5g(0.165mol/L)，加三蒸水900ml溶解，1mol/L NaOH调pH至7.0(25℃)，定容至1000ml，滤过消毒，4℃保存。

　　沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂18g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，调整pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。

　　YEPD培养液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900ml溶解，加入2mg/ml氯霉素水溶液50ml，定容至1000ml，高压灭菌后4℃保存。

　　1.1.3　试药与仪器　特苄康唑和布替萘芬(butenafine)由本院药物化学教研室提供，氟康唑(fluconazole)和酮康唑(ketoconazole)由本院有机化学教研室提供。DMSO为国产分析纯，用前重蒸。隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)；511型酶标分析仪(上海第三分析仪器厂)。

　　1.2　方法

　　1.2.1菌液制备　取酵母于实验前接种至1ml YEPD培养液，35℃，250r/min振荡培养16h，活化2次，使之处于指数生长期后期，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液调整菌液浓度至1×10³～5×10³个/ml。

　　取霉于实验前接种至SDA斜面，35℃，培养一周，活化2次，使菌落覆盖SDA斜面，加适量RPMI1640培养液，用吸管吹打菌落，使霉孢子游离于RPMI1640培养液中，然后经四层无菌纱布过滤。培养液经血细胞计数板计数后，加RPMI1640培养液调整孢子浓度至1×10³～5×10³个/ml。

　　1.2.2　药液制备　受试药物分别用DMSO配成6.4g/L溶液，-20℃保存，实验前，将6.4g/L药物贮存液取出置35℃温箱融化，用RPMI 1640培养液稀释10倍，充分混匀，使成640mg/L，备用。

　　1.2.3　药敏板制备　取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640 100μl作空白对照；3～12号孔各加新鲜配制的菌液100μl；2号孔分别加菌液190μl和受试化合物溶液10μl。2～11号孔10级倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125和0.0625mg/L，各孔中DMSO含量均不超过0.5%；12号孔不含药物，作阳性对照。各药敏板于35℃培养。

　　1.2.4　MIC值判定　念珠菌、新生隐球菌及霉分别于35℃培养24、72h和1周后，用酶标分析仪于620nm测各孔OD值。与阳性对照孔比，以OD值下降80%以上的最低浓度孔中的药物浓度为MIC₈₀(真菌生长80%被抑制时的药物浓度)。当药物的MIC₈₀值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC₈₀值高于最高浓度32mg/L时，计为“＞32mg/L”；MIC₈₀值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.0625mg/L”。

　　上述实验均平行操作2到3次，当MIC₈₀值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC₈₀值^［11］；当MIC₈₀值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。

　　2　结果

　　2.1　菌液浓度对MIC₈₀值的影响

　　取白念珠菌ATCC76615及其2株耐药菌，于YEPD培养液中两次活化后，均用RPMI 1640稀释成1×10³个/ml和1×10⁴个/ml两个浓度，分别测定特苄康唑、氟康唑和酮康唑在不同浓度菌液中的MIC₈₀值，考察在微量液基稀释药敏实验中，菌液起始浓度对药物MIC₈₀的影响(Tab.1)。实验结果证明，在1×10³～1×10⁴个/ml浓度范围内，菌液起始浓度的改变没有显著影响药物对各菌的MIC₈₀值。

Tab.1　　Effect of initial cell concentration on MIC₈₀s

　　(MIC₈₀,mg/L)

　　a:Candida albicans ATCC76615.

　　b:isolates resistant to fluconazole.2.2　培养时间对MIC₈₀值的影响

　　取3株白念珠菌和2株新生隐球菌，在药物作用不同时间后，测定各MIC₈₀值，考察药敏板的培养时间对实验所得MIC₈₀值的影响程度。对于新生隐球菌，在培养时间增加24h后，各药物的MIC₈₀值均增加一个浓度，而培养时间增至1周时，各MIC₈₀值分别提高4～16倍(Tab.2)。对于白念珠菌，培养时间对实验所得MIC₈₀值的影响更大，当培养时间增加24h时，各药物对白念珠菌的MIC₈₀值分别增加2～128倍(Tab.3)。因此，在实验中应严格控制药敏板的培养时间，准时进行结果测定，以便得到准确的实验结果。

Tab.2　　Effect of incubation time on MIC₈₀s for Cryp-

　　tococcus neoformans (MIC₈₀,mg/L)

　　a:incubation time (day);

　　b:Cryptococcus neoformans ATCC32609;

　　c:a clinical isolate.

Tab.3　　Effect of incubation time on MIC₈₀s for

　　Candida albicans (MIC₈₀,mg/L)

　　a:Candida albicans ATCC76615;　b:incubation time (day);

　　c:isolates resistant to fluconazole.2.3　药敏实验

　　本实验分别建立了酵母和霉的微量液基稀释药敏实验方法，并以氟康唑、酮康唑和布替萘芬为对照，考察了新化合物特苄康唑对包括深部真菌、浅表真菌和皮下组织真菌在内的12种临床常见真菌的体外抗菌活性，各菌株对化合物的敏感性用MIC₈₀表示(Tab.4)。结果显示，除烟曲霉外，特苄康唑对其他11种真菌的MIC₈₀均在4mg/L以下，尤其对酵母，除耐药株，其MIC₈₀值基本上在0.125mg/L以下，显示出卓越的体外抗真菌活性。

　　2.4　联合用药

　　取药敏实验中的药物溶液等量混匀，作为联合用药的原始药液制备药敏板，使各单一成分的终浓度均为16～0.031mg/L，分别用微量液基稀释法考察特苄康唑和氟康唑与布替萘芬的联合抑菌效果。特苄康唑与布替萘芬合用，可降低各自的MIC值，尤其对新生隐球菌的抗菌活性大大增加(Tab.5)。

Tab.4　MIC₈₀s of terbiaminazole,fluconazole,ketoconazole and butenafine for fungi (mg/L)

　　a:the ratios of MICs of fluconazole to them of terbiaminazole;　b:isolates resistant to fluconazole;

　　c:the concentrations of compounds in inoculum was from 64～0.125mg/L.

Tab.5　Combination effects of terbiaminazole and fluconazole with butenafine for 10 isolates of fungi(MIC₈₀,mg/L)

　　a:com 1,Combination effect of terbiaminazole and butenafine;　b:com 2,Combination effect of fluconazole and butenafine.3　讨论

　　近年来，由于新的条件致病性真菌感染不断出现，真菌耐药菌株不断增多，抗真菌药物研究越来越成为人们研究的热点，与此同时，抗真菌药物的敏感性实验也越来越受到人们的重视^［12］。建立一个准确可靠，重现性好，且简便易行的抗真菌药物敏感实验方法，对于准确快速地测定新化合物的抗真菌活性，指导抗真菌新药的设计和合成具有重要意义，而且，临床对真菌病的成功治疗，也有赖于准确快速地测定感染菌株对现有抗真菌药的敏感性。

　　美国国家临床试验标准化委员会(NCCLS)于1992年提出了对两性霉素B、5-氟胞嘧啶、酮康唑和氟康唑的药敏实验方案^［10］，即酵母的液基稀释抗真菌药物敏感实验参考方案。该方案公布后，被多个实验室采用，得到了令人满意的可重复性结果^{［13，11］}。但是对于霉，目前还没有建立一个标准的药物敏感实验方案。由于原本罕见的曲霉病在爱滋病患者中的发病率越来越高；生活质量的提高也使人们对以前未被重视的顽固的皮癣病治疗提出了新要求，研究对霉有特效的抗真菌药物和建立标准的抗真菌药物敏感实验方法，已成为当前抗真菌药物研究中一个突出而需急待解决的问题。Oh等^［14］曾用生物细胞生长跟踪装置检测曲霉菌丝的生长速度并测定两性霉素B对曲霉的抗真菌活性，但未能得到普及。

　　本实验参照NCCLS方案，在建立酵母药敏实验方法的同时，还建立了霉的微量液基稀释药物敏感实验方法。进行霉药敏实验，关键在孢子溶液的制备。Pujol等提出^［15］，用玻棒将霉刮下，经强烈涡旋制成混悬液，再用RPMI 1640配成需要的浓度。我们发现，该法容易使菌液中混入菌丝和培养基，影响实验结果。我们直接用RPMI 1640培养液适度冲洗霉的菌落，并用四层无菌纱布过滤，所得孢子溶液虽然浓度较低，但无菌丝、培养基等杂质干扰。用该法制备的孢子溶液稍作浓度调整后便可直接用于药敏实验，所得实验结果稳定，重现性好。霉药敏实验方法的建立为客观、全面考察化合物对酵母和霉、深部和浅表真菌的抗真菌活性创造了条件。我们选择临床较常见的12种真菌：包括5种深部真菌(新生隐球菌、白念珠菌、热带念珠菌、平滑念珠菌和近平滑念珠菌)，3种浅表真菌(石膏状毛癣菌、石膏状小孢子菌和羊毛状小孢子菌)，3种皮下组织真菌(裴氏着色真菌、紧密着色真菌和申克氏孢子丝菌)，另外还有烟曲霉，用于全面考察新化合物的体外抗真菌活性。

　　在药敏实验过程中，还存在着许多影响因素。其中，培养基的选择是影响MIC值的重要因素之一。Pfaller等研究证实，RPMI 1640培养液可产生较稳定的药敏实验结果^［16］。国内也有报道^［17］，用RPMI 1640培养液可使氟康唑的体外抗真菌活性与临床疗效相吻合，提示氟康唑的体内外抗真菌活性表现不一致可能与使用传统的沙堡培养液进行药敏实验有关。因此，本实验也采用了NCCLS推荐的RPMI 1640培养液。

　　实验中我们发现，在1×10³～1×10⁴个/ml范围内，菌液起始浓度的改变并不影响药物的MIC值，这使药敏实验变得容易操作，不必再为实验前精确测定菌液浓度而费周折。但药敏板培养时间的长短会影响药物的MIC值。由于新生隐球菌的繁殖速度相对较慢，当培养时间延长24h时，对药物的MIC值影响不大，但对于白念珠菌，如果培养时间延长24h，药物的MIC值就会急剧升高，将严重影响测试结果。可见，为了保证实验的准确性和可重复性，严格控制药敏板培养时间，准时进行结果测定是很有必要的。

　　本文以氟康唑、酮康唑和布替萘芬为对照，用微量液基稀释法测定了氮唑类新化合物特苄康唑对上述12种临床常见真菌的MIC₈₀值，较全面地考察了特苄康唑的体外抗真菌活性和作用特点。特苄康唑除对烟曲霉作用稍差(MIC₈₀=16mg/L)，对其他霉的MIC₈₀值在0.25～4mg/L之间，作用强于氟康唑，对酵母，其MIC₈₀值更普遍低于0.125mg/L，活性达氟康唑的8～256倍。考虑到氟康唑的体外抗真菌活性较差，与其高效的体内活性不一致，实验中又设了酮康唑对照组，实验结果表明，特苄康唑对各种真菌的体外抗真菌活性与酮康唑相当。上述实验结果证明特苄康唑在体外具有广谱、高效的抗真菌活性，并具有氮唑类化合物的作用特点。

　　特苄康唑与布替萘芬联合使用，两者抗真菌活性具有相加或协同作用，特别对新生隐球菌，两者协同作用明显，MIC₈₀值远远低于各自原来的MIC₈₀，可能与两种药物分别作用于真菌的CYP51酶和角鲨烯环氧化酶，形成双酶抑制作用有关。但氟康唑与布替萘芬联合使用，协同和相加作用不明显。上述现象有待进一步研究。

　　实验结果证明，通过计算机辅助设计合成的氮唑类化合物特苄康唑已基本达到预期设计目的，在体外表现出广谱、高效的抗真菌活性，是计算机辅助药物设计的又一成功典范。特苄康唑的作用机制和体内活性还有待进一步研究。

　　国家自然科学基金资助项目,批准号39870869;军队“九五”医药科研规划重点课题,项目编号96Z030.上海市科技发展基金资助,批准号98QB14009.

　　曹永兵,男,生于1971年,硕士,助教.

　　参考文献

　　1，Stevens D A.Therapy for opportunistic fungal infections:past,present and future.Indian J Cancer，1995；32(1)：1

　　2，寥万清,吴绍熙.真菌病研究进展.上海：第二军医大学出版社，1998；6：11(第一版)

　　3，Mitchell T G,Perfect J R.Cryptococcosis in the era of AIDS-100 years after the discovery of Cryptococcus neoformans.Clin Microbiol Rev，1995；8(4)：515

　　4，Muller J.Pathogenesis,immunobiology and epidemiology of cryptococcosis.Mycoses，1994；37(Suppl 1)：34

　　5，Alexander B D,Perfect J R.Antifungal resistance trends towards the year 2000.Drugs，1997；54(5)：657

　　6，Shyadehi A Z,Lamb D C,Kelly S L,et al.The mechanism of the acyl-carbon bond cleavage reaction catalyzed by recombinant sterol 14 α-demethylase of Candida albicans (other names are:lanosterol 14 α-demethylase,P-45014DM,and CYP51).J Biol Chem，1996；271(21)：12445

　　7，Terrell C L.Antifungal agents,part Ⅱ,the azoles.Mayo Clin Proc，1999；74(1)：78

　　8，季海涛，张万年，周友骏，等.白色念珠菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶三维结构分子模型研究.生物化学和生物物理学报，1998；30：583

　　9，季海涛，张万年，周友骏，等.氮唑类抗真菌药物药效构象及其与酶活性位点对接.药学学报，1999；34(4)：280

　　10，Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing for yeasts:proposed standard M27-P.National Committee for Clinical Laboratory Standards,Villanova,Pa.1992

　　11，Pfaller M A,Barry A L.Evaluation of a novel colorimetric broth microdilution method for antifungal susceptibility testing of yeast isolates.J Clin Microbiol，1994；32(8)：1992

　　12，Ghannoum M A,Rex J H,Galgiani J N,et al.Susceptibility testing of fungi:current status of correlation of in vitro data with clinical outcome.J Clin Microbiol，1996；34：489

　　13，Custem J V,Kurata H,Matsuok A,et al.Antifungal drug susceptibility testing.J Med Veter Mycol，1990；30(Suppl)：267

　　14，Oh K,Matsuoka H,Sumita O,et al.Automatic evalution of antifungal volatile compounds on the basis of the dynamic growth process of a single hapha.Appl Microbial Biotechnol，1993；38：790

　　15，Pujol I,Guarro J,Liop C,et al.Comparison study of broth macrodilution and microdilution antifungal susceptibility tests for the filamentous fungi.Antimicrb Agents Chemother，1996；40(9)：2106

　　16，Pfaller M A,Rinaldi M G,Galgiani J N,et al.Collaborative investigation of variables in susceptibility testing of yeasts.Antimicrob Agents Chemother，1990；34：1648

　　17，王文莉，王端礼，李世萌，等.NCCLS方案检测氟康唑对酵母菌的最小抑菌浓度.中华皮肤科杂志，1996；29(5)：374

收稿：1999-07-19