冷冻电镜两大供应商PK：赛默飞 VS. 日本电子
前不久，中国化信的医药团队分享了为何冷冻电镜被认为是最有前景的结构生物学研究技术。（详见 《【化信医药】中国化信医药咨询带你进入冷冻电镜的世界》 ）有人在后台留言说，日本电子这牌子没听说过啊？也有人说，日本电子的冷冻电镜在国内没有实验室在用吧，全都是用的赛默飞家的。的确，日本电子目前在国内只有武汉病毒所一台，并因为疫情的影响，2020年中旬才安装好。
同样是300kV冷冻电镜，到底差异在哪里呢？
• 首先， 电子枪类型的不同对两种仪器的属性差异影响很大。赛默飞的冷冻电镜配备 热场电子枪，灯丝温度在3000度左右，功率为0.8-0.9ev。这种电子枪的特点是稳定性比较好，但是它的单色性较差，并且使用寿命仅2-3年左右。而日本电子的冷冻电镜配备了 冷场电子枪，灯丝温度在在1500度左右，功率为0.3ev。这种电子枪的单色性较好，使用寿命在10年左右，但是每24小时需要重新refresh设置。
• 其次， 自动进样系统不同。赛默飞的冷冻电镜拥有12个样品同时进出的自动进样系统，而日本电子冷冻电镜的自动进样系统虽然也有12个槽位，但是仅支持4个样品同时进出。
• 能量过滤器方面，赛默飞一般使用赛默飞自己品牌的或者GATAN BioQuantum，而日本电子使用日本电子自己的Omega能量过滤系统。
• 在其它方面，虽然日本电子的价格相对较低，但是赛默飞目前市场份额较大，用户群体更多，品牌知名度更高，并且国内的工程师团队也更加成熟。
冷冻电镜的数据收集软件与图像处理软件PK
在介绍软件之前， 我们再来回顾一下冷冻电镜分析大分子的基本流程。
冷冻电子显微镜的基本原理是在超低温环境下冷冻固定样品，使得样品中的水分子以玻璃态的形式存在，在低温条件下将电子枪射出的电子作为光源，电子透过样品和其附近的冰层发生散射，然后利用电磁透镜系统把散射的信号成像记录下来，最后通过三维重构的技术得到样品的三维结构。
基本流程：冷冻电镜进行大分子结构分析流程包括样品准备、负染/初筛、冷冻制样、参数设置与冷冻样初筛、数据采集、结构解析以及最后的模型搭建几个步骤。
• 样品准备：
蛋白的纯化是冷冻电镜使用中非常重要的一环， 蛋白纯化的品质对于最后结构的分辨率有很大的影响。蛋白的主要表达系统有4种，分别是大肠杆菌系统、酵母细胞系统、哺乳动物系统以及昆虫细胞系统，其中大肠杆菌系统为原核系统，剩余的三种为真核系统。而蛋白质的提纯技术以亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析以及疏水层析为主。
• 负染初筛：
负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色。吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处被薄层重金属盐铺满，而凸出的地方则没有染料沉积，从而出现负染效果。染色后在电镜下观察，被观察的对象为亮的，背景为暗的。负染结果可以用来初步判断样品的质量是否适合继续使用冷冻电镜分析。
• 冷冻制样：
在这一步需要将溶液状态下的样品铺展在载网上，形成很薄的样品液层（液层厚度取决于样品颗粒大小），然后再将载网投入液态乙烷中进行快速冷冻。快速冷冻后的样品将转变成无定型状态的冰（玻璃态的样品），该状态下的样品中不含冰晶，不会破坏生物样品本身的结构，也不会导致电子衍射干扰数据收集。快速冷冻后的样品对透射电镜中的电子辐射耐受能力大大提高，且冷冻后的样品颗粒呈现的是样品自然状态下的形貌。
• 样品成像及三维重构：
样品的成像需要依靠高功率的冷冻电镜对样品进行拍摄， 目前主流的冷冻电镜为赛默飞的300kV Titan Krios冷冻电镜。赛默飞是目前最大的高端冷冻电镜供应商， 占据全球90%以上的市场。剩余的市场被日本电子占据，日本电子在国内仅武汉有一台300kV冷冻电镜。 目前蛋白质三维结构的三维重构方法以单颗粒分析法为主。
最后使用软件进行数据收集和图像处理分析。
在 数据收集方面将介绍两款常用软件 EPU2和SerialEM。
• EPU2是赛默飞使用的一种自动筛选和数据采集工具，专用于高效采集这类大型高质量数据集。该软件需要 收费使用，但是它不仅可以采集必要数量的高分辨率图像进行3D重构和处理，还拥有友好的UI设计，便于操作。更重要的是这个软件可对多个载网进行自动批量的筛选、分类操作来提升数据收集的效率。
• SerialEM是一个 开源软件，它可以适配赛默飞与日本电子的多型号冷冻电镜，并且拥有自动对焦、自动对齐以及自动调整强度等高级功能辅助数据收集。
在 图像处理方面将介绍另外两款常用软件 RELION和cryoSPARC。
• 开源软件 RELION可以选择特定参数进行调整以得到更精准的结果，并且可以最大化CPU与GPU的用户，提升数据处理的效率。
• 收费软件 cryoSPARC可以通过随机梯度下降法、分支界限最大似然优化法等函数引入以及显微镜数据的预处理，减少人为因素对最终3D模型的影响。
结
语
冷冻电镜作为新兴的结构生物学工具，相关产业目前仍处于发展初期。相信随着冷冻电镜技术的不断进步以及在结构生物学应用的成熟，这项技术能够在药物研发、病毒研究甚至在临床等领域造福大众。
本文作者：姚昌蔚
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