对于对探针法qPCR实验室涉足未深的小白们来说，qPCR的结果不理想，首先想到的就是检查操作过程，再优化反应体系，但是对于体系中至关重要的引物探针，却很容易忽略“食材”本身对实验的影响。因为拿到手的就已经是确定序列的合成品了，这里除了定量偏差、批间差还会有其他差别吗？
当然有区别！同样是做饭，相同的材料不同的手法做出来的味道可是会有天壤之别，引探的合成也是这样，这一篇小编就向行业资深研发人员学习引探的合成与产品表现力之间的关系，来看看大佬是怎样回复的吧~
探针法检测作为qPCR检测金标准，目前更为广泛的应用于对检测准确度要求较高的场景中，如传染病检测，而引物探针就是决定检测灵敏度与特异性的关键。
以新冠病毒（SARS-Cov-2）检测为例，对于“好”的引探表现力就包括：
1）检测灵敏度，灵敏度高就能够更好的避免漏检；
2）检测特异性，避免假阳性，增加产品容错率；
以上两点是最为重要的筛选条件，除此之外还有：
3）反应用时，也就是反应速率；
4）引探原料的用量，要确保引探在不同的条件下可以有良好的体系兼容性。
引探如此重要，如何才能够向分子诊断客户提供更好的引物探针呢？
这也就是引探合成“进化”需要考虑的问题，对于相同的序列和反应体系，可以通过合成“进化”来提升产品的表现力。
那怎样通过引探合成“进化”来提高检测的灵敏度和特异性呢？
好问题，在qPCR加样时，我们相当于把一堆分子加到了一起。如何PCR酶的扩增速度和qPCR仪的升降温速度现在都很快了，所以PCR反应在“毫秒”的范围内就能够完成。如果引物结合上去了，但探针未结合就完成了反应，那就会出现通过荧光反馈的扩增效率不高的情况，各厂商之间相同序列下会出现差异，这个就需要B总来解释原因了。
我们研发团队重点研究引物探针与模板结合的亲和力，所以说对于“好”的引物探针合成，其与模板的亲和力高，我们会剔除一些内部称为“没有生物活性”的引物探针。
当然有，比如说我们都知道亚磷酰胺合成后刚得到的粗品其实包含了很多的杂质，包括重金属、盐离子还有反应中的试剂原料等核酸外杂质，就需要不同的纯化工艺来去除。另外探针合成的选择也很重要，如超淬（SQ）可以有效降低本底荧光信号的干扰，提高检测灵敏度；MGB探针增加了亲和力，变相的也提高引物Tm值；锁核酸（LNA）可以提高探针的热稳定性与靶序列的亲和性等等。
实际也是有的，要看选择的MGB修饰基团的化学基团的差异了。
我们测试过，不同的供应商合成的探针引物，在产品只做功能验证时差异不算巨大，但当做极限条件优化和稳定性优化时差异就会很大，有些供应商提供的原料就是达不到想要的效果，我们只是知道有差异，但并不知道差异的原因在哪里。
我们PCR实验室在做产品功能性开发上主要使用两个方法，一个是在合成阶段优化*****过程，增加引探的生物活性，提高反应速率；另一种就是在上一个问题中所说的要尽量在纯化过程中去除核酸外杂质，减少对反应体系的影响。
合成的引探定量后，会跟据使用需求计算用量。我们的客户在实际操作过程中，常会出现偏差，比如由于挥发或者移液误差等，这时，对于已经定量的引探来说，投入量就会变化，所以需要反应体系有足够的兼容性。如果相同的要求下引物探针用量少，那在兼容性方面就能够表现更优秀一些，另外也能降低原料成本。相同的检测限下，我们选择可以使用最小量的引物探针投入量，还要保证体系的稳定性。
