导语：现有的狂犬疫苗以狂犬病毒糖蛋白（RABV-G）为靶点，由于该蛋白在生理条件下是异质的，所以只能产生短暂的免疫反应，也就是说狂犬病疫苗并不能为人体提供终身保护。近日，来自美国拉霍亚免疫学研究所和法国巴斯德研究所领导的研究团队首次捕获到狂犬病病毒糖蛋白三聚体与“预融合”特异性中和抗体结合的高分辨率三维结构，为长效狂犬疫苗的设计与开发提供了新的思路。
未经治疗的狂犬病感染几乎100%致死，每年导致50000至60000人死亡，其中很多是儿童。人用狂犬病疫苗由灭活病毒组成，仅在短期内（接种疫苗6个月至一年）具有完全保护作用，无法引发终身免疫。在人体中，疫苗引发的中和抗体水平通常在接种疫苗后1至5年下降，所以需要频繁接种疫苗以维持中和抗体滴度，提供对狂犬病感染的保护。而在大多数狂犬病死亡发生率较高的低收入国家，很难负担得起经常接种疫苗以及接触病毒后的治疗。因此，长效狂犬病疫苗的研发很关键。
狂犬病毒糖蛋白(RABV-G)是病毒表面暴露的唯一蛋白质，是疫苗诱导的中和抗体的靶点。在病毒表面，RABV-G的结构是异质的，只有一部分是可识别的三聚体。而结构的异质性可能会影响针对第四表位的中和抗体的产生，并可能导致接种后免疫应答的时间较短。
在最近的一项研究中，来自美国拉霍亚免疫学研究所和法国巴斯德研究所领导的研究团队报道了与人抗体RVA122结合的三聚体野生型RABV-G的结构，可用于指导改进疫苗的设计和确定治疗药物靶点。相关研究成果以“Structure of the rabies virus glycoprotein trimer bound to a prefusion-specific neutralizing antibody”为题，发表在Science Advances上。
图1 研究成果（图源：[1]）
科学家无法准确地回答为什么狂犬病疫苗不能提供长期保护，但RABV-G结构的异质性确实是一个关键性问题。就像瑞士军刀一样，RABV-G的序列可以在需要时展开并向上翻转。糖蛋白可以在融合前（与宿主细胞融合之前）和融合后形式之间来回移动，它也可能分崩离析，从三聚体结构转变为单体结构。
这种变形方式彷佛为狂犬病病毒提供了一种隐形斗篷，因为人类抗体通常只能识别蛋白质上的某个单一位点，而当蛋白质隐藏或移动这些蛋白质位点时，抗体就无法准确识别，自然也就无法产生有效的免疫应答。
在这项研究中，研究人员将糖蛋白RABV-G与单克隆抗体RVA122结合，以确定病毒结构中容易受到抗体攻击的位点。RVA122是狂犬病免疫所需的抗体类型，可以有效地中和狂犬病病毒。与RVA122的结合使通过冷冻电子显微镜可见的RABV-G三聚体的比例增加了30倍以上，使高分辨率重建成为可能，并将RABV-G锁定在融合前构象中，这是因为RVA122可能通过抑制RABV-G向融合后构象的转变来中和狂犬病病毒。
图2 与中和抗体RVA122结合的融合前RABV-G三聚体的结构（图源：[1]）
图3 RVA122（绿色）与RABV-G（深蓝色和浅蓝色）之间的相互作用（图源：[1]）
通过冷冻电子显微镜设备，研究人员捕获到了RABV-G的高分辨结构图像，这一结构凸显了病毒结构的两个关键部分——融合肽在自然状态下的形态。当RABV-G三聚体没有锚定在胶束或细胞膜上时，融合肽要么是无序的，要么是相互作用的。这些结果表明，除了在内体酸化后驱动病毒和细胞膜的融合之外，融合肽还影响糖蛋白胞外域结合和三聚化。
为了确定融合肽是否也影响全长RABV-G的构象和稳定性，研究人员将融合肽点突变体表达为全长糖蛋白，包括跨膜结构域和胞质尾，并用流式细胞术和免疫荧光对其进行分析染色。RABV-G突变体的所有全长版本都很好地表达并且容易到达细胞表面，但含有W121A的突变体，融合前构象中的全长蛋白明显减少。这一结果表明，对于全长糖蛋白，W121通过与膜相互作用来稳定融合前构象，防止糖蛋白转变为替代构象。W121和病毒膜之间的相互作用也可能使RABV-G稳定在病毒粒子表面。
RABV-G是疫苗的重要组成部分，也是抗体治疗和潜在抗病毒药物的靶标，但其存在的结构异质性可能导致次优抗体反应。融合前的三聚体RABV-G将是一种理想的疫苗免疫原，但由于该分子的不稳定性，这种形式的呈现存在一定挑战性。而该项研究报告了融合前三聚体RABV-G的结构，证明了融合肽对成功三聚化和构象稳定的重要性，还可视化了有效和广泛中和抗体表位，这些将共同指导、改进狂犬病疫苗的研发以及暴露后的治疗。
通过该项研究，科学家们对狂犬病病毒结构有了更加清晰的认识，也为长效狂犬疫苗的设计研发打开了大门，甚至可以预防整个狂犬病病毒属。根据研究人员所说，下一步工作是捕获更多狂犬病病毒及其亲属病毒的图像以及中和抗体，科学家们正在努力发现其中几个病毒结构，这可能会揭示狂犬病病毒共有的抗体靶点。
该项研究的第一作者表示：“狂犬病是我们所知道的最致命病毒之一，千年以来，我们一直生活在它的阴影之下。然而，科学家们却从未观察到它表面的分子结构。了解这种结构，就像了解病毒如何进入宿主细胞一样，对于开发更有效的疫苗和治疗方法至关重要”。
